先通过噬菌体介导的同源重组方法构建突变菌株，然后构建同源交换位点（AES），随后将其整合到结核分枝杆菌噬菌体基因组，获得噬菌粒（phasmid）；将噬菌粒导入耻垢分枝杆菌，获得整合有同源交换位点的重组噬菌体，经体外扩增获得高滴度的重组噬菌体，对结核分枝杆菌进行转染；将转染后的结核分枝杆菌涂布到潮霉素抗性的固体培养基，37℃培养4-5 周，挑取单克隆，通过PCR 等方式进行验证。

目前已成功构建结核分枝杆菌近4000 个基因的重组噬菌体，适用于后期快速获得结核分枝杆菌基因敲除菌株，同时我们已成功获得600 多个结核分枝杆菌基因敲除突变菌株。